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當前位置 -> 新聞資訊
->DDRT-PCR技術(shù)的改進? |
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RNA的純凈度是RT-PCR實驗成功與否的關(guān)鍵之一。一般認為合適而使用TRIzol試藥盒提出取得RNA，但此法很難絕對去除基因組DNA，需求用DNase處置。更簡單方便的辦法是運用mRNA挑選性PCR反響考劑盒（例如大連寶有生命的物質(zhì)工程有限企業(yè)出產(chǎn)的試藥盒），其原理是在 RT-PCR中因為運用了dNTP analog，減低了合成的cDNA的Tm值，在PCR反響時，cDNA可在較低溫度（85 ℃）下改變性別，故只有Tm值較低的cDNA可以被擴增，而基因組 DNA因為低溫下不可以改變性別，故不可以作為反響的模型板被擴增。?
預(yù)設(shè)引物首先務(wù)必遵循以下原則[6]：①在不論什么方向的閱覽框中均無終止password子；②無形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的傾向；③序列中應(yīng)涵蓋哺乳動物最常見的password子；④GC含量在60％～70％之間；⑤盡力少用甘氨酸password子；⑥引物之間應(yīng)無交聯(lián)傾向；⑦引物中不應(yīng)顯露出來蟬聯(lián)兩個以上的堿基可折轉(zhuǎn)配合成雙互補。Liang等(1992)預(yù)設(shè)的第一代引物：3′端引物為5′T12MN，理論上3′引物可遮蓋mRNA總類的1/12,5′端引物為?20種10 mer引物，同3′端引物共有240種組合。Liang等(1994)所預(yù)設(shè)的第2代引物改兩個堿基固定的Oligo（dT）引物為一個堿基固定的引物，即T12A，T12G和T12C，且在引物的5′端各引入了一個HindⅢ酶切位點，5′端和3′端引物共有60種組合。第3代引物于1996年預(yù)設(shè)，GenHunter企業(yè)3′端poly(dT)錨定引物和5′端隨機引物都帶上HindⅢ酶切位點，引物條數(shù)作別減為3條和8條，而堿基數(shù)作別增加至18個和13個，這么經(jīng)計算機同源性剖析表明所獲得的24個組合一樣能遮蓋全部mRNA，使操作和后續(xù)處置更簡單方便、敏捷。MouL等(1994)在引物預(yù)設(shè)上發(fā)覺，引物中含至少一個G比含一個C要好，以A或T為末端者速率很低，5′端GC組合比3′端GC組合速率要高。?
據(jù)近期技術(shù)報導(dǎo)，13 mer隨機引物的最佳退火溫度范圍是40 ℃～50 ℃；延長時間為30 s～120 s效果最佳；dNTP的液體濃度范圍為2 μmol/L～50 μmol/L；隨機引物的液體濃度為0.1 μmol/L～2.0μmol/L之間，依據(jù)所抽樣品靈活掌握。也有研究討論迅速DDRT-PCR辦法[7]，其前提條件是務(wù)必增長dNTP的液體濃度（從2.5 μmol/L增長至25μmol/L或250μmol/L），根據(jù)是在68 ℃～80 ℃范圍內(nèi)，Taq- DNA聚合酶的延伸效率為100 nt/s，按溫度變更率1 ℃/s計算，從68 ℃向80 ℃升溫的過程中可擴增1.2 kb的DNA。?
只有長度為100～500個堿基的擴增條帶才適應(yīng)于測序膠上顯露[1]。電泳時不時發(fā)覺大多數(shù)帶成簇顯露出來，其端由有可能是同一cDNA斷片的互補帶或3′末端A導(dǎo)致的泳動速度差別引動的。Bauer等（1993）初次將非改變性別凝膠電泳用在差顯技術(shù)上，根據(jù)是大部分數(shù)雙鏈DNA在非改變性別聚丙烯酰胺凝膠中的搬遷效率大略與其體積的log對數(shù)字成反比，但搬遷率也受其堿基組成和序列的影響，致使體積絕對相同的DNA其搬遷率可相差達10％，此辦法減低了顯露譜帶的復(fù)雜性，同時簡化了后期施行克隆用篩子選的辦公。電泳終了后，施行放射自顯影。有用32P或 33P接替原辦法中的32S，因為32P或33P的能+羭縷高且牢穩(wěn)，可增長電泳條帶放射自顯影的辯白力，縮減暴光時間，同時，將同位素標記反響底物dNTP改為末端標記錨定Oligo(dT)引物，使只有5′端和3′端引物之間的擴增加產(chǎn)量物能力被顯露，而兩個5′端引物之間的擴增加產(chǎn)量物則不被顯露，這么就減損了“人工條帶”導(dǎo)致的假陽性，增長了銳敏度和特別優(yōu)異性。
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